深水稻为什么能适应水淹胁迫？|群体遗传专题

水是植物赖以生存的重要环境因子，但凡事过犹不及。大量的水会导致植物被淹没，在水淹生境中，植物处于厌氧或缺氧状态，有氧呼吸受限；同时，可利用光源削减导致光合作用受阻，这些因素对植物的生物量和生存力造成严重威胁。在东南亚地区，每年有长达4-5个月时长的恶劣水淹环境，对于农作物而言无疑是灭顶之灾。物竞天择，适者生存。种植在亚洲低洼地区的水稻品种采用“节间生长”（internode elongation）的策略来应对长达数月的水淹胁迫。深水稻（deepwater rice）通过节间快速生长来增加株高，使叶片保持在水面以上，保障正常的气体交换和光合作用。极端情况下，在洪涝季节深水稻能以每天20-25cm的速度生长，最终株高能达到数米。

  图1. 深水处理下常规水稻与深水稻的株高差异

日本名古屋大学Motoyuki Ashikari教授研究团队关于深水稻水淹胁迫响应机制的研究成果相继在Science和Nature杂志发表。今天，让我们走进2018年发表在Science上题为“Ethylene-gibberellin signaling underlies adaptation of rice to periodic flooding”的研究论文，去探寻其背后的研究思路和科学逻辑。

文章全景概况结果解读

1.  GWAS联合连锁分析实现水淹胁迫响应基因的精细定位

该研究以水稻10-叶期水淹处理7天后的节间长度（Total internode length 7 days after submergence, TILS; cm）作为表型指标，对收集得到的68种水稻品种（包括：40个深水稻品种，27个籼稻品种，1个粳稻品种）进行全基因组关联分析。基因分型平台为44K的SNP水稻芯片，过滤缺失值 > 25%和MAF < 5%的标记，共得到27,182个SNP，使用“滑窗法”（sliding window method）将单个SNP基因型转化为单倍体数据（haplotype data），利用混合线性模型（mixed linear model, MLM）对控制目标性状TILS进行GWAS定位。如图1所示，在全基因组范围的5,433个haplotype subset中，有6个超过了阈值（P < 0.05/5,433），极值点位于1号染色体上，而该QTL在之前水淹响应的研究中已有报道。 

图2.  TILS 性状全基因组关联分析Manhattan图

那么，对于1号染色体上的水淹响应qTIL1^C9285，到底是什么基因在起作用？之前的群体遗传学专题中有讲过，对于GWAS关联区间target region选取的方法，一种是peak score上下游200kb的范围，另一种是依赖于连锁不平衡分析（LD block）。而该研究为了进一步缩小定位范围，找到具体的causal基因，采用的策略是：利用近等基因系（Near Iso-genic Lines, NIL）杂交后代的重组信息，对目标区段进行高密度连锁分析，从而实现精细定位。近等基因系具有遗传背景相同，而只在目标性状基因区段存在差异的特性，因此是在基因水平上开展遗传研究的理想材料。该研究团队在之前对水淹胁迫QTL定位的研究中，利用回交和分子标记辅助选择相结合的方法构建了含有水淹胁迫QTL区段的NILs，其遗传背景来自于non-deepwater水稻品种T65，水淹胁迫导入片段来自于deepwater水稻品种C9258。基于NILs群体的高密度连锁分析，将qTIL1C9285的范围缩小至1号染色体上5.5 kb的区域（图3）。该区域包含基因OsGA20ox2（Oryza sativa gibberellin 20-oxidase 2），也就是著名的“绿色革命”基因SD1（SEMIDWARF1，半矮秆基因1）。SD1使得水稻植株较矮，从而具备抗倒伏、多产的特性。20世纪中期围绕SD1基因进行的矮化选择育种，使水稻的产量创造了新高，引发了全球第一次绿色革命。从本质上来说，deepwater rice和non-deepwater rice应对水淹胁迫的差异是由该区间DNA序列的差异导致的。分析目标区域多态性有两种方法：一种是基于单标记分析；另一种则是基于单倍型分析。本研究采用了后者。

图3. 连锁精细定位结果及regionA对水稻TILS的影响

2. 深水稻特有单倍型DWH（deepwater rice-specific haplotype）

对于 “基于单标记”和“基于单倍体型”两种关联分析方法，由于单个统计显著的标记只能解释数量性状很小一部分的遗传变异，且分型标记与目标位点之间存在不完全的连锁不平衡，因此，相较于单标记的关联分析，利用多等位基因区组信息的单倍型分析会显著提高关联分析的检验效力。单倍型（Haplotype）是指共存于染色体上等位基因的特定组合。一个特定的单倍型可能组成一个大等位基因，在数量性状的表型变异中起着决定性作用。因此，为了进一步探究深水稻应对水淹胁迫的分子机制，本研究分析了deepwater rice和non-deepwater rice在定位区域的单倍型差异。

为了确定GWAS分析的水稻品种在1号染色体定位区间的序列差异，该区域的40个多态性标记被用于单倍型分析（图4）。这些标记分别位于SD1的启动子区（p01~p38），外显子区（e01&e02）以及第二个内含子区（i01~i10）。在68个水稻品种中，共有6种单倍型类型（Hap1~Hap6），其中含有单倍型Hap6的水稻品种有最高的TILS值，其在SD1启动子区和内含子区含有17个特异性位点。因此，Hap6是深水稻品种特有单倍型，命名为DWH（deepwater rice-specific haplotype）。

图4. 栽培深水稻特有单倍型DWH

3.  SD1对上游乙烯信号的响应

植物在水淹胁迫下，组织器官内会产生乙烯。由于水体中气体的扩散速度远远低于空气，乙烯扩散受阻，因此植株内乙烯浓度迅速累积上升，达到植物体可感知响应的生理活性水平。根据定位结果可知，qTIL1^C9285的causal基因是SD1。那么，乙烯信号是如何与SD1交互作用，从而调控SD1转录表达？这需要进一步探究验证SD1的调控机制。

图5. 乙烯信号通路

在乙烯信号通路中，乙烯的积累会增强转录因子EIN3（ETHYLENE INSENSITIVE 3）的稳定性，从而激活下游响应基因的表达（图5）。因此，本研究利用EIN3在水稻中的同源蛋白OsEIL1a，来探究SD1的表达是否受EIN3类转录因子的调控。体外和体内实验均表明，OsEIL1a能直接结合SD1的启动子区，从而激活SD1的转录。然而，乙烯信号的升高并没有引起T65（Non-deepwater rice）中SD1的表达，说明存在某种未知的抑制因子，会阻止SD1的转录，而具有DWH的深水稻（C9258和NIL-1）则能部分削弱这种负调控，从而引发SD1的高表达，编码生成GA20-oxidase，参与赤霉素的生物合成。赤霉素（gibberellin, GA）是一类非常重要的植物激素，负责植物保持长时间的快速伸长生长。GA20-oxidase作用于赤霉素GA20和GA9的生物合成，转化生成有生物活性的GA1和GA4。因此，在水淹胁迫下，深水稻内生型赤霉素GA20、GA9、GA1和GA4浓度会随着时间增加而增大，但在T65中观测不到这种变化趋势（图5）。那么，水淹生境下SD1的转录表达具体是促进了哪一种赤霉素的生物合成，从而在宏观上实现深水稻的节间快速生长？

图5. GA20-oxidase参与GA1和GA4的生物合成

4.  SD1促进下游GA4的大量合成

在水淹生境中，无论是GA1还是GA4通路，SD1^C9285均比SD1^T65表现出更高的酶活性。如图6所示，在GA4通路中，SD1^C9285的酶活性约为SD1^T65的270倍。另外，SD1^C9285 GA₄通路的酶活性远远高于GA₁通路（约为19倍），说明SD1C9285转录表达生成的GA20-oxidase主要作用于GA₄通路，而非GA₁通路。为什么植物会选择用GA₄来完成水淹胁迫下的快速生长？作者进一步探究了不同类型赤霉素对生长的促进作用，发现在所有赤霉素种类中，GA₄具有最强促进生长的作用，其效力约为GA₁的10倍，这是由于GA₄和水稻赤霉素受体有更强的结合力，从而使赤霉素的生物效应增强。

图6. GA1和GA4通路酶活性比较

至此，我们可以从乙烯信号出发，完整地解释：为什么深水稻能适应水淹胁迫？如图7所示：当水稻处于水淹胁迫下，植株体内都会致使乙烯积累，从而增强转录因子OsEIL1a的稳定性，与SD1启动子区结合。深水稻具有的DWH单倍型能介导SD1高水平的转录表达，编码生成GA20-oxidase，其主要作用于GA₄的合成，内生合成的赤霉素最终实现水稻植株快速节间生长。而在不含有DWH单倍型的常规栽培稻中，只有极低水平的SD1转录，植株不能快速生长，因而无法适应水淹环境。

图7. 深水稻水淹胁迫应对机制

5.  DWH的起源和进化

为了探究DWH的起源和进化，该研究对149种亚洲栽培稻（Oryza sativa）和39种野生稻（Oryza rufipogon）进行单倍型分析，发现O. sativa和O. rufipogon享有同样的DWH。PCA和Admixture分析结果表明，栽培稻中DWH（+）品种均来自于孟加拉国的indica、aus和混合亚种。

那么DWH最初是从何进化而来？为了追溯DWH的起源，作者对野生水稻群体（wild accessions）SD1区域的核苷酸多态性进行了分析。如图6A所示，在258个野生稻中，有16个accessions含有DWH，隶属于W1、W4和W1混合亚群。那么，野生稻中DWH的出现是不是因为来源于O. sativa的基因流？如果该假设为真，由于种植稻中的核苷酸多样性低于野生稻，则期望的π比值[π_DWH(+)/π_DWH(-)]应该小于1。但是，观测到的π比值接近于1（图6B），故原假设不成立，说明DWH是天然野生群体本身存在的变异，且DWH出现于野生稻W1-W4亚群分化时期。再者，位于同一支的DWH(+) 中（图6A中clade of DWH origin），有3个accession与C9285共享SD1区域所有的48个多态性位点，说明孟加拉深水稻栽培种的DWH直接起源于野生稻的这一分支。

图6. 野生水稻天然种群在SD1区域的核苷酸多态性分析

如图7所示，在绿色革命中，SD1通过“loss-of-function”来减少赤霉素的合成，从而形成抗倒伏、多产的水稻品种；而在周期性出现的洪涝灾害中，SD1则通过“gain-of-function”来增加赤霉素的合成实现快速节间生长，来应对水淹胁迫。同一基因在不同环境因子的选择下，会朝完全相反的方向进化，说明植物适应策略的内在复杂性和可塑性。全球气候变化带来栽培稻生境的变化，天然野生稻基因池中存在的变异或许能为现有栽培稻提供新的材料和途径。

图7. SD1在矮杆稻和深水稻中发挥不同作用

总结

该研究联合GWAS和连锁分析，实现了对水淹胁迫QTL的精细定位，进一步发现深水稻在定位区域的特有单倍型DWH，并探究了栽培稻和野生稻中DWH的起源和进化。在水淹胁迫下，DWH的存在引发深水稻中SD1基因高水平的转录表达，促进赤霉素GA₄的大量合成，作用于节间快速生长。本研究之所以能快速将分析焦点集中于1号染色体的QTL区，一部分原因得益于之前研究结果的沉淀积累。再者，构建的近等基因系（NILS）为水淹胁迫QTL的精细定位和目标区段基因功能的研究提供了绝佳材料。该团队在此研究方向上的长期深耕，最终在分子调控和群体进化层面展现了“深水稻水淹胁迫响应”的全景图，这对我们未尝不是一种启示和鼓励。

参考文献：

Kuroha et al. 2018. Ethylene-gibberellin signaling underlies adaptation of rice to periodic flooding. Science [J], 361: 181-186. doi: 10.1126/science.aat1577

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